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ISSN : 1226-0088(Print)
ISSN : 2288-7253(Online)

Membrane Journal Vol.31 No.3 pp.219-227
DOI : https://doi.org/10.14579/MEMBRANE_JOURNAL.2021.31.3.219

Preparation and Characteristics of P(AN-co-MA) Membrane Imprinted with Lysozyme Molecules

Kyoung Won Min, Anna Yoo, Kyung Ho Youm†

Department of Engineering Chemistry, Chungbuk National University, Cheongju, Chungbuk 28644, Korea

^†Corresponding author(e-mail: khyoum@cbnu.ac.kr, http://orcid.org/0000-0002-1724-543X)

Received June 14, 2021 ; Review June 24, 2021 ; Accepted June 24, 2021

Abstract

Molecularly imprinted membrane (MIM) is a porous polymer membrane incorporating with the molecular recognizing sites. In this study, the supporting P(AN-co-MA) asymmetric membrane was prepared by nonsolvent induced phase separation (NIPS) method. And then, MIM with lysozyme template sites was prepared using the surface imprinting method on the P(AN-co-MA) asymmetric membrane introducing a photoactive iniferter and then photo-grafting. The P(AN-co-MA) asymmetric membrane was modified with 3-chloropropyltrimethoxysilane and dithiocarbamate as a photoactive iniferter. To prepare a lysozyme imprinted membrane, the modified P(AN-co-MA) membrane was copolymerized with acrylamide as a functional momomer, N,N'-methylene bisacrylamide as a crosslinker and lysozyme as a template in the UV irradiation environment. The lysozyme imprinted MIM was analyzed by using SEM, FT-IR and EDS measurements. Its results confirm that all the P(AN-co-MA) membranes have an asymmetric structure and the iniferter group is successfully introduced on the membrane surface. The process parameters were adjusted to obtain MIM having the excellent lysozyme adsorption. The maximum lysozyme adsorption capacity reaches at 2.7 mg/g, which is 13 times higher than that of the non imprinted membrane (NIM). The permselective membrane filtration experiments of ovalbumin to lysozyme show that the P(AN-co-MA) MIM preferentially bounds a greater amount of lysozyme.

Key Words : Molecularly Imprinted membrane (MIM) , P(AN-co-MA) membrane , lysozyme , Photoactive Ininiferter , Permselectivity

라이소자임 분자각인 P(AN-co-MA) 막의 제조와 특성

민 경 원, 유 안 나, 염 경 호†

충북대학교 공과대학 공업화학과

초록

분자각인막(MIM)은 특정 분자의 결합자리를 갖고 있는 다공성 고분자 막이다. 비용매유도 상분리(NIPS)법을 사 용하여 분자각인막의 지지체로 사용될 P(AN-co-MA) 비대칭막을 제조하고, 여기에 표면 각인법을 적용하여 광활성 이니퍼터 도입과 photo-grafting을 통해 라이소자임 분자각인막을 제조하였다. P(AN-co-MA) 비대칭막을 3-chloropropyltrimethoxysilane과 광활성 이니퍼터 dithiocarbamate로 개질하고, acrylamide 단량체, N,N'-methylenebisacrylamide 가교제, 라이소자임 주형분자 혼합액을 UV 조사 환경에서 혼성중합 시켜 MIM을 제조하였다. 제조된 MIM의 FT-IR과 FE-SEM 및 EDS 분석을 실시한 결과 P(AN-co-MA) 막은 비대칭 단면 구조이었고 표면에 이니퍼터 그룹이 잘 결합되어 있어 MIM이 성공적으로 제조되었다. 제조공정의 변수 조절을 통해 라이소자임의 흡착량이 비각인막(NIM)에 비해 13배 큰 값인 2.7 mg/g을 갖는 P(AN-co-MA) 기반 MIM이 제조되었으며, 막여과 실험을 통해 라이소자임에 대한 오발부민의 투과선택도를 측정한 결과 MIM은 라이소자임의 선택적 결합력이 우수하였다.

키워드 :

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Funding:

1. 서 론

최근 의약과 의료 산업의 발전에 따라 다양한 기능성 바이오 물질의 수요가 커짐에 따라 이들 물질을 식물과 동물 등의 생명체로부터 추출하거나 생물반응에 의한 제조가 증가하고 있다. 그러나 기능성 바이오 물질의 대부분은 생물체에 소량 존재하며, 생물반응을 통한 제 조 시 배양액 내에 낮은 농도로 존재하며 다른 다양한 물질과 혼합되어 있어 의약 및 의료 산업에서 요구하는 순도로까지 정제하기 위해서는 고도의 분리정제 기술 이 요구된다. 기능성 바이오 물질의 고순도 분리정제에 적용이 가능한 기술의 하나가 막분리법이다. 특히 대표 적인 기능성 바이오 물질인 효소, 단백질, 아미노산 등 은 열에 의한 변성과 유기용매에 의한 성분 손상으로 인해 이들 물질의 고순도 분리정제에는 증류, 용매 추 출 및 결정화법보다 열과 유기용매의 사용이 없는 막분 리법을 적용하는 것이 바람직하다. 또한 막분리법은 에 너지의 소모가 작고, 조작과정이 단순하며, 물질의 신속 한 분리와 생산성이 커서 산업규모의 분리 정제에 적합 하다[1-5].

그러나 막분리법은 막의 세공 크기와 용질분자의 크기 차 즉, 체분리 효과(sieving effect)에 의해 물질 분리가 이루어지기 때문에 분자 크기와 구조가 유사한 물질의 선택적 분리가 어렵다. 이러한 문제를 해결하기 위한 방안으로서 분자 인식 및 선택성이 우수한 분자각인 고 분자(molecularly imprinted polymer, MIP)의 장점을 분 리막에 부여한 분자각인막(molecularly imprinted membrane, MIM)에 대한 관심이 증가하고 있다[6,7].

MIP는 생체분자를 인식할 수 있는 주형분자를 포함 하는 모노머를 중합시켜 고분자를 합성한 후 주형분자를 추출 제거함으로서 고분자 내에 주형분자 자리(template site)를 형성시켜 분자인식 기능을 부여하여 제조된다. MIP의 주형분자 자리는 공유결합이 아닌 수소결합, 정 전기적 상호작용 등의 비공유결합 기전을 통해 아미노산, 핵산, 단백질, 스테로이드 등과 같은 생리활성 바이오 물질을 인식한다[8].

조류 알의 난백(卵白), 동물의 침, 눈물, 젖 및 조직액 등에 존재하는 라이소자임(lysozyme; E.C. 3.2.1.17)은 박테리아 세포벽의 주성분인 점액 다당류의 β-1,4-글리 코시드 결합을 가수분해 시켜 박테리아를 사멸시키는 기능을 갖는 효소이다. 라이소자임은 항균 작용과 더불 어 항염증 및 항출혈 작용과 최근 암환자의 진정 작용 도 있는 것으로 밝혀지면서 의약·의료 분야에서 소염제 및 항생제로서 궤양, 감염, 상처의 치료와 암환자의 진 통제 및 백혈구 감소증 환자의 보조 치료제로서 중요하 게 사용되고 있다. 또한 라이소자임은 통조림, 소시지, 치즈, 가공 어육류 등에 첨가하여 식품의 천연 보존제 로도 사용되고 있다[9,10].

이처럼 라이소자임은 의약⋅의료용 항균제와 치료제 및 식품산업에서 천연 보존제로서 중요하게 사용되지 만 인공적으로는 합성되지 않기 때문에 부득이 라이소 자임을 함유한 조류의 알 및 동물의 체액으로부터 추출 된다. 특히 계란 난백(흰자, chicken egg white)에는 라 이소자임이 비교적 높은 농도(약 3.4 wt%)로 함유되어 있고, 계란은 쉽게 구입할 수 있기 때문에 라이소자임 의 안정된 주요 공급원이다[11,12].

본 연구에서는 주형분자로 라이소자임을 사용하고, 표면 각인법을 사용하여 라이소자임 분자를 각인시킨 poly (acrylonitrile-co-methyl acrylate)[P(AN-co-MA)] 막을 제조하고 특성을 평가하였다. 먼저 acrylonitrile (AN) 단 량체와 acrylic acid (AA)을 사용하여 제조된 P(AN-co-MA) 공중합체를 사용하여 비용매유도상분리(nonsolvent induced phase separation, NIPS)법으로 P(AN-co-MA) 비대 칭막을 제조하였다. 다음 단계로 3-chloropropyltrimethoxysilane (CPTMS)과 sodium N,N'-diethyldithiocarbamate (DTC)를 사용하여 P(AN-co-MA) 비대칭막의 표면을 개질시켜 광활성 이니퍼터(photoactive iniferter)를 도입 시켰다. 이 개질된 비대칭막에 단량체인 acrylamide (AM) 와 가교제인 N,N'-methylenebisacrylamide (MBAM) 및 주형분자인 라이소자임 혼합액을 흡수시킨 후 UV를 조사시켜 photo-grafting을 통해 라이소자임 분자각인 P(AN-co-MA) 막을 제조하였다. 제조된 P(AN-co-MA) 분자각인막의 물리화학적 특성 측정과 라이소자임의 흡착 실험 및 라이소자임과 오발부민 단백질 용액에 대 한 막여과 실험을 수행하여 분자각인막으로서의 특성을 평가하였다.

2. 실 험

2.1. 실험재료

NIPS법에 의한 비대칭막 제조를 위한 고분자로는 acrylonitrile (AN) 단량체와 acrylic acid (AA)을 사용하 여 제조된 P(AN-co-MA) 공중합체(Taekwang Industrial Co., Korea)를 사용하였으며, P(AN-co-MA)의 용매로 는 dimethyl sulfoxide (DMSO, Junsei Co., Japan)를 사 용하였다. P(AN-co-MA) 비대칭막을 개질시켜 광활성 이니퍼터를 도입시키기 위해 3-chloropropyltrimethoxysilane (CPTMS, Sigma-Aldrich Co.)와 sodium N,N'-diethyl dithiocarbamate (DTC, Samchun Co., Korea)를 사 용하였고, 이들의 용매로서 toluene (Samchun Co., Korea) 과 ethanol (Samchun Co., Korea)을 사용하였다. 개질 된 비대칭막에 분자각인 기능을 부여하기 위해 주형분 자로서 라이소자임(lysozyme, M_w = 14,300, Sigma-Aldrich Co.)과 단량체로서 acrylamide (AM, Sigma-Aldrich Co.) 및 가교제로서 N,N'-methylene bisacrylamide (MBAM, Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. 각인된 주형분자의 제거를 위해 acetic acid (Samchun Co., Korea)와 sodium dodecylsulfate (Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다. 제조된 P(AN-co-MA) 분자각인막의 투과선택도(permselectivity) 측정을 위한 막여과 실험에 라이소자임과 더 불어 오발부민(ovalbumin, M_w = 45,000, Sigma-Aldrich Co.) 단백질을 사용하였다.

2.2. 실험장치

개질된 P(AN-co-MA) 비대칭막을 photo-grafting시켜 라이소자임 주형분자를 각인시키는 광 중합반응은 자 외선 램프(Ultra Vitalx UV Lamp 300 W, E27 base, Osram Co.)가 장착된 UV 조사 장치(L 35 cm × W 35 cm × H 60 cm) 내에서 실시하였다.

라이소자임과 오발부민 단백질 용액을 대상으로 P(AN-co-MA) 분자각인막을 사용한 막여과 실험은 Fig. 1에 나타낸 전량여과(dead-end filtration) 실험장치에서 수행하였다. 라이소자임과 오발부민 단백질은 pH 6.5인 universal buffer에 1 g/L의 농도로 용해시켜 사용하였다. 실험장치는 용액 저장조, 막모듈(Model XFUF 04701, Solvent-resistant stirred cell 47 mm, 유효 막 면적 15.2 cm², Millipore Co., USA) 및 투과량 측정부(전자저울 과 PC)로 구성되어 있다. 압축 질소를 사용하여 용액 저 장조에 막여과의 구동압력을 가하면 단백질 용액이 저 장조로부터 막모듈로 이송되면서 막여과가 이루어진다. 이때 막투과량은 전자저울(Model FX-3000, AND Co., Japan)로 측정하여 일정 시간 간격으로 PC에 저장되며, 이 결과로부터 막투과 플럭스를 계산하였다.

2.3. 실험방법

2.3.1. P(AN-co-MA) 비대칭막의 제조

(주)태광산업에서 아크릴 섬유 생산을 목적으로 acrylonitrile (AN)과 acrylic acid (AA)를 공중합 시켜 제조된 P(AN-co-MA) 공중합체를 NIPS법에 의한 비대 칭막 제조에 사용하였다. NIPS법에 의한 P(AN-co-MA) 비대칭막의 제조 과정은 다음과 같다.

DMSO 용매에 P(AN-co-MA) 공중합체를 6 wt.% 비 율로 넣은 후 50°C에서 24시간 동안 교반시킨 후 탈기 (degasing)하여 캐스팅 용액을 준비한다. 이 용액을 깨 끗한 유리판 위에 약 450 ㎛ 두께로 필름 어플리케이터 (Lab-Q A300 Series, CK Trading Co. Korea)를 사용하 여 캐스팅시킨 후 23°C를 유지하고 있는 비용매인 물 속에 15분 동안 침지시켜 상변환 비대칭막을 제조하였 다. 제조된 비대칭막은 0.1 M의 아세트산과 순수로 수 차례 세척하여 잔존하는 DMSO 용매를 모두 제거하고 45°C에서 24시간 동안 건조시켜 데시케이터에 보관하 였다. 제조된 P(AN-co-MA) 비대칭막의 두께는 약 410 ㎛이었다.

2.3.2. P(AN-co-MA) 분자각인막의 제조

Lee 등[13]과 Prete 등[14]이 제시한 방법을 적용하여 P(AN-co-MA) 비대칭막의 표면에 존재하는 카복실기 (-COOH)에 광활성 이니퍼터(photoactive iniferter)를 도 입시켜 개질한 후, UV를 조사시켜 photo-grafting을 통 해 라이소자임 주형분자가 각인된 P(AN-co-MA) 분자 각인막을 제조하였다. P(AN-co-MA) 비대칭막에 광활 성 이니퍼터를 도입시키고 이를 photo-grafting시켜 라 이소자임 분자각인막을 제조하는 상세한 과정은 다음 과 같다.

먼저 NIPS법으로 제조된 P(AN-co-MA) 비대칭막을 용매인 toulene에 CPTMS를 10 wt.% 농도로 용해시킨 용액 중에 80℃에서 4시간 동안 침지시켜 막을 활성화 시킨다. 다음 단계로 활성화 처리된 막을 용매인 ethanol 에 광활성 이니퍼터인 DTC를 0.3 M 농도로 용해시킨 용액 중에 실온에서 18시간 침지시켜 광활성 이니퍼터를 도입시켜 막을 개질한다. 도입된 광활성 이니퍼터는 UV 조사에 의해 분열하여 라디칼을 생성하며, 중합반응 동 안 라디칼의 성장과 재결합의 반복을 통해 중합 사슬 길 이를 제어하고 반응 중합도를 조절하게 된다[14].

광활성 이니퍼터를 도입시켜 개질된 막의 photo-grafting 및 주형분자인 라이소자임의 각인은 다음의 절차로 수행하였다. 먼저 PBS 완충용액에 가교밀도 [cross-linking density % $= m_{M B A M} / (m_{M B A M} + m_{A M}) \times 100]$ 가 5 wt.%가 되도록 단량체인 AM 3.116 g과 가교제인 MBAM 0.164 g 용해시킨다. 다음으로 위의 AM과 MBAM의 혼합용액에 주형분자인 라이소자임을 각각 0, 6, 8, 10, 12, 14 wt.% 비율로 용해시킨 후 개질된 비대칭막에 6시간 동안 충분히 흡수시킨다. 이후 AM과 MBAM 및 라이소자임을 흡수시킨 막을 얼음 수조 위 에 살포시 올려놓고 UV를 2~10시간 동안 조사시켜 photo-grafting 반응을 수행한다. Photo-grafting 완료 후 10%의 acetic acid와 sodium dodecylsulfate를 사용 하여 라이소자임 주형분자의 제거를 통해 라이소자임 분자가 각인된 P(AN-co-MA) 막 제조를 완성하였다. Fig. 2에 P(AN-co-MA) 비대칭막 표면에 광활성 이니퍼 터의 도입 개질과 라임소자임 분자각인 과정의 화학적 구조 변화를 나타내었다.

2.3.3. P(AN-co-MA) 비대칭막, 개질막 및 분자각인막의 특성 평가

NIPS법으로 제조된 P(AN-co-MA) 비대칭막과 광활 성 이니퍼터가 도입된 개질막 및 라이소자임 분자각인 막에 대해 FT-IR (Model 480, Jasco Co., Japan) 분석 및 표면과 단면에 대한 FE-SEM (Model LEO-1530, Carl Zeiss Co., Germany) 측정을 통해 그 구조를 확인 하고 EDS 분석을 실시하여 물리화학적 특성을 평가하 였다.

또한 P(AN-co-MA) 분자각인막의 라이소자임에 대한 평형 결합용량(흡착량)을 다음의 절차로서 측정하였다. P(AN-co-MA) 분자각인막 0.03 g을 5 ml의 universal buffer (pH 5)에 넣어 30분간 침적시키고, 여기에 농도 를 알고 있는 라이소자임 용액 5 mL를 첨가하고 20℃, 60 rpm에서 12시간 동안 진탕시켜 흡착평형에 도달하 도록 한다. 막을 꺼내어 막에 흡착된 라이소자임을 탈 착시키기 위해 1 M의 KCl이 첨가된 완충용액 10 mL 에 침지시켜 20℃, 60 rpm에서 6시간 동안 진탕시키고, 이 용액의 흡광도를 280 nm의 파장에서 UV/Vis 분광 광도계(Model Lambda 35, Perkin-Elmer Co., USA)로 측정하고, 미리 작성된 검량곡선으로부터 라이소자임의 평형 흡착량(mg lysozyme/g membrane)을 계산하였다.

P(AN-co-MA) 분자각인막의 라이소자임에 대한 투과 선택도(permselectivity) 측정을 위해 막여과 실험을 수 행하였다. 막여과 실험은 계란 난백의 주요 구성 단백 질인 라이소자임과 오발부민 용액 각각에 대해 Fig. 1 의 전량여과 실험장치를 사용하여 1 g/L의 단백질 농도 와 막간 압력차(ΔP) 1 bar의 조건에서 2시간 동안 실 시하고, 투과액의 단백질 농도를 280 nm의 파장에서 UV/Vis 분광광도계를 사용하여 측정하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. P(AN-co-MA) 비대칭막, 개질막 및 분자각인막의 물리화학적 특성

NIPS법으로 제조된 P(AN-co-MA) 비대칭막과 광활성 이니퍼터를 도입시킨 개질막 및 라이소자임 분자각인막 의 FT-IR 분석 결과를 비교하여 Fig. 3에 나타내었다. 이 결과 P(AN-co-MA) 개질막에서는 비대칭막에서는 나타나지 않았던 1,642 cm^-1에서의 –C = S 결합과 990 cm^-1에서의 -CS 결합이 확인되어 이는 P(AN-co-MA) 비대칭막의 개질을 통해 광활성 이니퍼터인 DTC가 도입되었고, 또한 분자각인막에서는 AM과 MBAM의 공중합체 형성에 따라 1650 cm^-1에서의 C = O 결합과 1,500 cm^-1에서의 –NH 결합이 확인되었다[15]. 그리고 Fig. 4와 Fig. 5에 나타낸 P(AN-co-MA) 비대칭막과 개 질막의 EDS 분석 결과에서 보면 비대칭막에서는 검출 되지 않는 CPTMS와 DTCS 시약에 존재하는 S와 Si 원소가 개질막에서는 검출되어 광활성 이니퍼터가 도 입되었음을 확인하였다.

Fig. 6에 나타낸 P(AN-co-MA) 비대칭막 및 분자각 인막의 표면과 단면 SEM 사진 결과에서 보면 표면에 미세 기공을 갖고 있는 능동층과 그 밑에 finger-like 형 태의 거대 공극이 형성된 상변환막의 전형적인 단면 형 상인 비대칭 구조가 확인되며, 또한 분자각인막의 표면 에 photo-grafting 코팅층이 형성되어 단순 비대칭막에 비해 더 치밀한(more dense) 표면 및 단면 구조를 나타 내었다. 제조된 P(AN-co-MA) 비대칭막의 두께는 약 410 ㎛ 이었으며, 분자각인막의 두께는 약 430 ㎛이었 다. P(AN-co-MA) 비대칭막의 막간 압력차 1 bar에서의 순수 투과 플럭스는 230 LMH, 그리고 분자각인막의 순수 투과 플럭스는 photo-grafting 조건에 따라 달라져 150~200 LMH 범위이었다.

3.2. P(AN-co-MA) 분자각인막의 라이소자임 흡착 특성

3.2.1. 주형분자 농도의 영향

광활성 이니퍼터를 도입시켜 개질된 P(AN-co-MA) 막의 photo-grafting 및 주형분자의 각인 과정에서 AM 과 MBAM 간의 가교밀도를 5 wt.%로 고정시킨 조건 에서 주형분자인 라이소자임의 농도를 0, 6, 8, 10, 12, 14%로 변화시키면서 제조된 P(AN-co-MA) 분자각인막 의 라이소자임 평형 흡착량(mg lysozyme/g membrane) 결과를 Fig. 7에 나타내었다. 이 결과 photo-grafting 용 액 내 주형분자인 라이소자임의 농도가 0에서 10 wt.% 로 증가함에 따라 라이소자임의 평형 흡착량이 증가하 며, 이는 분자각인막에 라이소자임의 결합자리 형성이 증가하기 때문이다. 그러나 photo-grafting 용액 중 주형 분자인 라이소자임의 농도가 10 wt.% 이상인 조건에서 는 결합자리 형성이 포화상태가 되었으며, 라이소자임 농도 10 ~ 14 wt.% 범위에서 평형 흡착량(Q)은 평균 약 2.7 mg lysozyme/g membrane을 나타내었다. 이 결 과로부터 P(AN-co-MA) 분자각인막의 제조 시 주형분 자인 라이소자임의 농도는 10 wt.%가 가장 적절하였다.

3.2.2. UV 조사시간의 영향

Photo-grafting 중합 과정에서 UV 조사시간은 막 표 면에서 중합되는 AM과 MBAM 간의 가교 결합층의 두께와 균일성을 좌우하는 변수이다. Fig. 8에 주형분자 인 라이소자임의 농도 10 wt.%인 조건에서 photo-grafting의 UV 조사시간을 2, 4, 6, 8, 10시간으로 달리하여 제조된 P(AN-co-MA) 분자각인막의 라이소자임에 대한 평형 흡착량 결과를 나타내었다. 이 결과 UV 조사시간이 길수록 라이소자임의 평형 흡착량이 증가하였으며, 이 는 UV 조사시간이 길수록 이니퍼터의 활성이 커져 중 합 고분자 네트워크 형성의 증가로 인해 더 많은 라이 소자임의 결합자리가 형성되었기 때문이다[14]. 그러나 UV 조사시간 6시간 이상에서는 흡착량의 증가가 완만 해져 2.6~2.8 mg lysozyme/g membrane 범위의 흡착량 값을 나타내며, 또한 UV 조사시간 8시간 이상인 조건에 서는 과도한 UV 조사로 인해 지지층인 P(AN-co-MA) 막에 미세 크랙 발생 등의 막 손상이 발생하였다. 이 결과로부터 P(AN-co-MA) 분자각인막의 제조 시 UV 조사시간은 6시간이 가장 적절하였다.

3.2.3. P(AN-co-MA) 분자각인막과 비각인막의 라이소자임 흡착특성

최적 조건(광활성 이니퍼터 농도 0.3 M, 주형분자 농 도 10 wt.%, UV 조사시간 6시간)에서 제조된 P(ANco- MA) 분자각인막(MIM)과 주형분자가 없는 조건(주 형분자 농도 0)에서 제조된 비각인막(NIM)의 라이소자 임 흡착량을 비교하여 Fig. 9에 나타내었다. 이 결과 MIM의 라이소자임 평형 흡착량은 NIM의 흡착량 값과 비교하여 약 13배 증가하였으며, 따라서 P(AN-co-MA) 비대칭막에 존재하는 카복실기(-COOH)에 광활성 이니 퍼터를 도입시킨 후 photo-grafting을 통해 분자각인막을 제조하는 표면각인 제조법의 유용성이 확인되었다.

3.3. P(AN-co-MA) 분자각인막의 단백질 투과선택도

P(AN-co-MA) 분자각인막의 라이소자임에 대한 투과 선택도(permselectivity) 평가를 위해 계란 난백의 주요 구성 단백질인 라이소자임과 오발부민 용액 각각에 대해 Fig. 1의 전량여과 실험장치를 사용하여 단백질 농도 1 g/L, 막간 압력차(ΔP) 1 bar의 조건에서 2시간 동안 막여과 실험을 수행하고, 막여과 시간에 따른 투과액의 단백질 농도를 측정하여 투과선택도를 계산하였다. 계란 난백 내 단백질 조성비는 오발부민(M_w = 45,000, 54~57 wt.%), 콘알부민(M_w = 80,000, 12~15 wt.%), 라이소자임 (M_w = 14,300, 3.4 wt.%) 및 오보뮤신(M_w = 1.5~8.3×10⁶, 3~4 wt.%)으로 알려져 있으며[10], 이에 본 논문에서는 계란 난백 내 단백질 중 라이소자임과 분자량이 가장 근접한 오발부민을 투과선택도 비교 단백질로 선정하 였다. P(AN-co-MA) 분자각인막(MIM)과 비각인막(NIM) 을 사용하여 라이소자임과 오발부민 단백질 용액(농도 1 g/L) 각각에 대해 2시간 동안 막여과 실험을 수행하고, 투과액 중의 단백질 농도 측정값으로부터 다음의 식으로 MIM과 NIM의 투과선택도를 계산하였다.

α_{o b / l y} = \frac{C_{p o b} / C_{f o b}}{C_{p l y} / C_{b l y}}

(1)

여기서 C_fob와 C_pob는 각각 공급액과 투과액 중의 오발부민의 농도이고, C_fly와 C_ply는는 각각 공급액과 투과액 중의 라이소자임의 농도이다. 이때 투과선택도 α_ob/ly 값이 1이면 막에 의한 라이소자임과 오발부민의 선택 투과성이 없으며, 만일 α_ob/ly 값이 1보다 크다면 막과 라이소자임 분자와의 결합 증가로 인해 라이소자 임보다 오발부민을 더 선택적으로 잘 투과시킴을 뜻한 다. 즉, α_ob/ly 값이 1보다 크면 농축액에는 라이소자임 의 농도가 증가하게 되고, 투과액에는 오발부민 농도가 증가하게 된다.

P(AN-co-MA) 분자각인막(MIM)과 비각인막(NIM)을 사용한 막여과 실험을 통해 측정된 막여과 시간에 따른 투과액 내 라이소자임과 오발부민의 농도 변화 결과를 Fig. 10에 나타내었으며, 식(1)을 사용하여 계산한 막여 과 시간에 따른 MIM과 NIM의 투과선택도 변화를 Fig. 11에 나타내었다. 이 결과 Fig. 10에 나타낸 것과 같이 MIM과 NIM 모두 막여과 시간에 따른 투과액 내의 라이소자임과 오발부민의 농도는 서서히 감소하였으며, 이는 막여과 시간이 증가함에 따라 막오염이 점차 더 형성되면서 단백질의 투과가 제한되기 때문이다. Fig. 11에서 보면 P(AN-co-MA) 분자각인막(MIM)의 투과 선택도는 초기 1에서 점차 증가하여 막여과 1시간 이후 에는 약 1.18의 평형 값에 도달하였으며, 반면 NIM의 경우에는 2시간의 막여과 시간 전체 범위에서 투과선택 도가 1로서 라이소자임과 오발부민의 선택 투과성이 없 었다.

본 연구에서 제조된 분자각인막은 P(AN-co-MA) 공중 합체에 존재하는 카복실기(-COOH)에 이니퍼터를 결합 시키고 photo-grafting을 통해 분자인식 특성이 우수한 분자각인막의 제조가 가능하였으며, 특히 P(AN-co-MA) 공중합체의 우수한 기계적 특성과 제막 용이성을 고려 하면 향후 막 크로마토그래피(membrane cromatography) 등에 적용하여 기능성 바이오 물질의 고순도 분리정제에 활용이 가능하다.

4. 결 론

P(AN-co-MA) 비대칭막을 기반으로 하여 표면 각인 법의 적용과 photo-grafting 공정변수 조절을 통해 라이 소자임 분자각인막을 제조하고, 제조된 막의 물리화학 적 특성과 라이소자임에 대한 평형 흡착용량과 투과선 택도를 측정하여 P(AN-co-MA) 분자각인막 제조와 특 성을 연구한 결과 다음의 결론을 얻었다.

1. Dimethyl sulfoxide 용매에 P(AN-co-MA) 공중합 체를 6 wt.%로 용해시킨 캐스팅 용액을 사용하여 비용 매유도 상분리법으로 230 LMH의 순수 투과플럭스를 갖는 비대칭 구조의 P(AN-co-MA) 상변환 막을 제조하 였다.
2. 표면 각인법을 적용하여 P(AN-co-MA) 비대칭막 에 광활성 이니퍼터인 dithiocarbamate 기를 도입시키고, photo-grafting을 통해 라이소자임이 각인된 P(AN-co-MA) 기반 분자각인막을 성공적으로 제조하였다.
3. 라이소자임에 대한 흡착량이 가장 우수한 P(ANco- MA) 분자각인막 제조를 위한 최적 조건은 광활성 이니퍼터 농도 0.3 M, 가교밀도 5 wt.%, 주형분자 농도 10 wt.%, UV 조사시간 6시간이었다.
4. P(AN-co-MA) 분자각인막의 라이소자임에 대한 평형 흡착량은 2.7 mg/g으로서 이는 라이소자임이 각 인 되지 않은 막에 비해 약 13 배 높은 값이었다.
5. P(AN-co-MA) 분자각인막을 사용하여 라이소자임과 오발부민 단백질 용액 각각에 대한 막여과 실험 결과, 라이소자임에 대한 오발부민의 투과선택도가 약 1.18로서 단백질 혼합액 중 라이소자임의 선택적 분리에 P(ANco- MA) 분자각인막의 활용이 가능함을 확인하였다.

Figures

Fig. 1.

Experimental system for the dead-end membrane filtration.

Fig. 2.

Schematic procedure for the preparation of P(ANco- MA) molecularly imprinted membrane by photo-grafting induced by photoactive iniferter.

Fig. 3.

FT-IR spectra of the P(AN-co-MA) (a) asymmetric membrane, (b) modified membrane by photoactive iniferter, (c) molecularly imprinted membrane.

Fig. 4.

EDS results of the P(AN-co-MA) asymmetric membrane.

Fig. 5.

EDS results of the P(AN-co-MA) modified membrane by photoactive iniferter.

Fig. 6.

FE-SEM photographs of the P(AN-co-MA) (a) asymmetric membrane and (b) molecularly imprinted membrane.

Fig. 7.

Equilibrium adsorption of lysozyme on the P(AN-co-MA) molecularly imprinted membrane prepared with different template concentrations. [iniferter conc. = 3 M, cross-linking density = 5 wt.%, UV irradiation time = 6 h.]

Fig. 8.

Equilibrium adsorption of lysozyme on the P(AN-co-MA) molecularly imprinted membrane prepared with different UV irradiation times. [Iniferter conc. = 3 M, cross-linking density = 5 wt.%, template conc. = 10 wt.%]

Fig. 9.

Equilibrium adsorption of lysozyme on the P(AN-co-MA) molecularly imprinted membrane(MIM) and non imprinted membrane(NIM). [ Iniferter conc. = 3 M, cross-linking density = 5 wt.%, template conc. = 10 wt.%, UV irradiation time = 6 h.]

Fig. 10.

Trends of lysozyme and ovalbumin concentration in permeate with membrane filtration time for the P(AN-co-MA) (a) molecularly imprinted membrane(MIM) and (b) non imprinted membrane(NIM). [Feed conc. = 1 g/L, ΔP = 1 bar].

Fig. 11.

Trends of permselectivity with membrane filtration time for the P(AN-co-MA) molecularly imprinted membrane(MIM) and non imprinted membrane(NIM). [Feed conc. = 1 g/L, ΔP = 1 bar].

Tables

References

T. H. Choi, and H. B. Park, “Membrane and virus filter trends in the processes of biopharmaceutical production”, Membr. J., 30, 9 (2020).
J. Lee, J. Lee, and Y. Baek, “Ultrafiltration and diafiltration processes for concentration and formulation of antibody-based therapeutics”, Membr. J., 30, 373 (2020).
A. L. Zydney, “New developments in membranes for bioprocessing - A review”, J. Membr. Sci., 620, 118804 (2021).
I. Park, S. Y. Yoo, and H. B. Park, “How to design membrane chromatography for bioseparations: A short review”, Membr. J., 31, 145 (2021).
K. H. Youm, H. Y. Lee, and Y. C. Shin, “Water treatment using separation membranes”, pp. 25-27, Sin-A Publishing, Jeju, Korea (2011).
P. Fan, and B. Wang, “Preparation of molecularly imprinted polymer membrane with blending trimethoprim- MIP and polysulfone and its transport properties”, Korean J. Chem. Eng., 26, 1813 (2009).
M. Yoshikawa, K. Tharpa, and S. Dima, “Molecularly Imprinted Membranes: Past, Present, and Future”, Chem. Rev., 116, 11500 (2016).
S. A. Piletsky, T. L. Panasyuk, E. V. Piletskaya, I. A. Nicholls, and M. Ulbricht, “Receptor and transport properties of imprinted polymer membranes - A review”, J. Memb. Sci., 157, 263 (1999).
R. Ghosh, and Z. F. Cui, ʻPurification of lysozyme using ultrafiltration”, Biotech.. Bioeng., 68, 191 (2000).
H. R. Park, and K. H. Youm, “Separation of lysozyme from chicken egg white by ultrafiltration (1) - Dead-end filtration of egg white solution”, Membr. J., 26, 266 (2016).
E. Y. Lee, and G. J. Woo, “Separation of highly purified antimicrobial lysozyme using ultrafiltration and characteristics of membrane fouling”, Korean J. Food Sci. Technol., 31, 458 (1999).
Y. Matsuoka, “Egg white lysozyme”, J. Japan Soc. Food Nat., 24, 311 (1971).
H. Y. Lee, and B. S. Kim, “Grafting of molecularly imprinted polymers on iniferter-modified carbon nanotube”, Biosens. Bioelectron., 25, 587 (2009).
M. C. Prete, D. M. Dos Santos, L. Effting, and C. R. T. Tarley, “Preparation of molecularly imprinted poly(methacrylic acid) grafted on iniferter-modified multiwalled carbon nanotubes by living-radical polymerization for 17β -estradiol extraction”, J. Chem. Eng. Data, 64, 1978 (2019).
S. J. Dong, “Preparation and characterization of molecular imprinting polymer membranes based on P(AN-co-MA) and cellulose”, Master's Thesis, Chungbuk National University, Chungbuk, Korea (2014).